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营养性多肽的开发(下)

发布时间:2019-06-14 17:44阅读次数:

《 多肽营养学 》

2019年6月号 周刊出版 2019年第7期

本文源自:《多肽营养学》 主编:陈栋梁

营养性多肽的开发(下)

前情提要

90年代,多肽领域研究进入了一个崭新的发展阶段。大量的研究结果表明:生物体内含量极微的活性肽在生命过程中起着重要的调控作用。这些活性肽与生物的发育、生长代谢、免疫、疾病、学习、记忆和衰老都有极其密切的关系,因而引起了各国科学家包括有机化学家、生物化学家、药物化学家、结构化学家等与生命科学有关的科学家的高度重视。多肽现在作为一种食品、药品被广泛的研究和开发,有些多肽在生物体内含量高,易于分离提取,而有些需要从蛋白质中酶解得到,还有一些多肽是非天然的,需人工合成。然而合成多肽的方法因其原料昂贵,产率低且不易提纯,给研究者带来不少困难。因此对多肽的合成方法进行不断简化和改进成了多肽研究工作者最主要的任务。


营养性多肽的开发主要有以下几种方式:

看点

03

人工合成法制备多肽

1、固相合成法

近年来固相多肽合成方法在聚合物载体、连接分子、保护基、缩合方法和切割条件等方面的应用有长足的发展。多肽的全合成不仅具有重要的理论意义,而且具有重要的应用价值,对化学、生化、医药、免疫及分子微生物学等领域都起了巨大的推动作用。


Merrifield 创建并发展了多肽的固相合成方法。这种方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性,应用这一神奇的方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。其基本原理如下图所示:


2、多肽片段连接方法

近年来出现的多肽片段连接方法( peptide ligation )成为多肽和蛋白质合成领域中方法学上的又一重要进展。多肽连接是指使用非保护的多肽片段,不需要酶及化学偶联试剂的活化,通常在水溶液中即可完成的多肽接长反应,产物容易纯化,产率较高。多肽连接时对原料的N端和C端的化学结构有特定要求,由特定的N端和C端间的化学选择性反应得到连接产物。



看点

04

基因工程法制备多肽

基因工程药品是基因工程技术应用于医药研制的产物,是分子生物学、遗传工程技术迅速发展的结果。基因工程技术应用于多肽医药研制的基本原理是:把机体内控制那些可用于医药目的的蛋白质或活性多肽的合成的相应基因分离出来,并在体外进行重组,然后再在适宜的宿主中表达。1977年美国首次应用基因工程技术生产出了人生长激素,至今已出现了一大批基因工程药品,有的正处于研究中,有的已用于临床并投人大规模生产。


人体活性多肽(如激素、淋巴因子、神经多肽、酶类凝血因子、调节蛋白酶等)的生产一般来源于哺乳动物(鼠,猴),难度大、成本高、产量低、副作用大,应用基因工程技术却可大大改善这一状况。目前研究的基因工程活性多肽药物约60种,已经商品化的主要是基因工程干扰素。其生产原理是:采用DNA重组技术、将人α、β、γ干扰素基因与一定的质粒重组成杂交质粒,转化大肠杆菌,在细菌或噬菌体启动子的调控下产生干扰素。基因工程干扰素不含糖分子,但与自然干扰素一样具有多种生物学活性。此外,白细胞介素淋巴毒素、肿瘤坏死因子、人胰岛素等通过重组DNA在大肠杆菌中的表达已获得成功,有的已开始临床试验研究。


自1979年底以来,不少人和动物的干扰素基因已经克隆成功。人干扰素基因在原核细胞中已可高效表达,每升大肠杆菌菌液可以生产1-2克干扰素,相当于2~3×1011国际单位干扰素。采用DNA重组技术生产的干扰素具有与自然干扰素相同的生物学活性,目前已经投放市场。采用基因工程技术还可以把几个不同型别的干扰素基因拼接起来,生产具有不同性格的自然界所没有的活性多肽物质,例如把αD-αA基因拼接后产生的干扰素,既具有αD的某些性状,又具有αA的一些性状。所以DNA重组技术为生产人造抗病毒多肽物质开辟了一条新途径。除干扰素外,其他多种淋巴因子,如白细胞介素-2、肿瘤坏死因子等,也都可以采用DNA重组技术大量生产。在重大疾病防治方面具有重要意义。



看点

05

化学修饰法制备多肽

多肽类药物经聚乙二醇共价修饰后能明显改善其药学性质,如降低免疫原性、增加对蛋白水解酶的稳定性、增加水溶性及延长体内的半衰期等。蛋白质的聚乙二醇化修饰研究已取得较好的效果,多肽的聚乙二醇化修饰研究起步较晚,主要是对多肽和蛋白质的N端、C端及某些氨基酸侧链进行选择性聚乙二醇化修饰。因此多肽结构中通常存在多个氨基,所以需要控制和确定修饰位点及修饰程度。


1、多肽链中羧基的聚乙二醇化修饰方法

Lu等以mPEG-NH2作原料修饰天冬氨酸侧链羧基得到Fmoc-Asp( mPEG - NH )-0H,将其用到固相多肽合成中实现聚乙二醇对肽链中天冬氨酸侧链羧基的修饰。也可以在合成过程中用烯丙基( Alyl ) 保护特定位置的天冬氨酸侧链羧基,肽链组装完毕后在固相上先脱除Alll,再将mPEG-NH2偶联到天冬氨酸侧链羧基上,实现对肽链中特定天冬氨酸侧链羧基的聚乙二醇修饰。此法适用于Fmoc固相多肽合成法中对天冬氨酸或谷氨酸的定点聚乙二醇修饰。在固相多肽合成中,若先将Fmoc-NH-PEG-COOH偶联到树脂上,再合成肽链,最后用三氟乙酸裂解,可以实现肽链C末端羧基的聚乙二醇化修饰。


2、多肽中流悲的聚乙二醇化修饰方法

Campbell等在生长激素释放因子(GRF)类似物的C端引人半胱氨酸,在mPEG上引人巯基吡啶,然后通过二硫键交换实现mPEG对GRF类似物C端的修饰。



看点

06

色谱分离法制备多肽

采用色谱分离的方法分离纯化天然的活性多肽。通常采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、液相色谱一串联质谱。


方法举例如下:

蛇毒镇痛多肽的分离纯化:将溶胀好的CM-SephadexC-25装入色谱柱( 2.6cm x 60cm ),用0.01mol/L磷酸盐缓冲液( pH值6.0 )平衡。1000.0mg粗毒溶于同种缓冲液中,上样。先用平衡缓冲液洗出前2个峰,再用直线梯度(0.00~0.65mol/LNaCl ) 洗脱,流速为36ml/h,6管/h。将收集到的活性组分经冷冻干燥,脱盐,再浓缩;进一步用SephadexG-50柱(1.6cm×100cm)纯化,洗脱液为0.15mol/LNH4Ac缓冲液( pH值7.0 ),流速为16ml/h,4管/h。得到的活性组分通过一个已用0.15mol/LNH4Ac平衡好的CM-Sepha-dexC-25柱(1.6cm×120cm),直线梯度 ( 0.15~0.60mol/LNH4Ac ) 洗脱,流速为16ml/h,4管/h。收集活性组分冷冻干燥,得蛇毒镇痛多肽单一组分。产品达到色谱纯级别。



看点

07

噬菌体表面展示肽库法制备多肽

噬菌体表面展示技术是近年来出现的一种新技术,它将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面。应用该技术所构建的噬菌体展示短肽库,经与对应靶分子反复筛选后,所得到的短肽序列可以发挥其生物活性。该技术在分子间识别研究/多肽疫苗开发/受体激动剂/拮抗剂研究/酶的底物/抑制剂研究/药物筛选/蛋白质工程的改造等方面表现了广泛的应用前景。同样,在蛋白质体的酶解产物中生物活性肽成分的筛选与功能研究方面,也具有极大潜力。


1、噬菌体展示系统的构建理论基础

噬菌体展示系统是一种将外源肽/蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。若展示的是随机肽或蛋白质,则为噬菌体展示库,结合适当的生物筛选方法,可以对多肽、蛋白质或核酸等生物分子的某些功能进行探索和筛选,从而实现在体外的快速进化。在此重点介绍噬菌体表面展示肽库技术。


2、噬菌体表面展示随机肽库的应用

目前该技术已广泛用于①抗原决定簇的定位;②人工制备抗体;③确定激素或受体的结合序列或酶的底物序列;④筛选受体的激动剂入拮抗剂或酶的抑制剂/激活剂;⑤发展多肽药物;⑥筛选非肽结合蛋白(如streptavidin)或非蛋白分子(如DNA)的多肽结合序列;⑦发展多肽诊断试剂和多肽疫苗研制。

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